Après avoir été licencié de la Ligue Anti-Villain pour avoir échoué à capturer le dernier méchant capable de menacer l'humanité, Gru se trouve confronté à une crise d'identité majeure. Mais quand se présente un étranger mystérieux qui l'informe du décès de son père mais aussi de l'existence d'un frère jumeau - un frère qui veut désespérément suivre les traces méprisables de son jumeau - un ancien super-méchant va redécouvrir à quel point c'est bon d'être mauvais.

Ayant abandonné la super-criminalité et mis de côté ses activités funestes pour se consacrer à la paternité et élever Margo, Édith et Agnès, Gru, et avec lui, le Professeur Néfario et les Minions, doivent se trouver de nouvelles occupations. Alors qu’il commence à peine à s’adapter à sa nouvelle vie tranquille de père de famille, une organisation ultrasecrète, menant une lutte acharnée contre le Mal à l’échelle planétaire, vient frapper à sa porte. Soudain, c’est à Gru, et à sa nouvelle coéquipière Lucy, que revient la responsabilité de résoudre une série de méfaits spectaculaires. Après tout, qui mieux que l’ex plus méchant de tous les temps, pourrait attraper celui qui rivalise pour lui voler la place qu’il occupait encore récemment...

Dans un charmant quartier résidentiel délimité par des clôtures de bois blanc et orné de rosiers fleurissants se dresse une bâtisse noire entourée d’une pelouse en friche. Cette façade sinistre cache un secret : Gru, un méchant vilain, entouré d’une myriade de sous-fifres et armé jusqu’aux dents, qui, à l’insu du voisinage, complote le plus gros casse de tous les temps : voler la lune (Oui, la lune !)... Gru affectionne toutes sortes de sales joujoux. Il possède une multitude de véhicules de combat aérien et terrestre et un arsenal de rayons immobilisants et rétrécissants avec lesquels il anéantit tous ceux qui osent lui barrer la route... jusqu’au jour où il tombe nez à nez avec trois petites orphelines qui voient en lui quelqu’un de tout à fait différent : un papa. Le plus grand vilain de tous les temps se retrouve confronté à sa plus dure épreuve : trois fillettes prénommées Margo, Édith et Agnès.